一．预约与收费规则
1.仪器使用时间：每周四和周六。 10：00-16：30；(9:00-10:00为机器启动及光路校正时间，16:30后为仪器管路清洗消毒时间)；
2.预约请直接联系崔娜进行人工确认。
3.使用仪器前请至少提前一周向仪器负责人预约，并告知仪器负责人具体实验内容，仪器负责人根据仪器使用情况安排上机时间，如取消预约须至少提前一天告知仪器负责人，否则一律按照2小时收费；
（仪器负责人：崔娜 联系电话：021-68582512 邮箱：cuina@sioc.ac.cn）
4.收费标准：
院内用户： 500元/小时；院外学术用户850元/小时；院外非学术用户1300元/小时。
二．样品制备要求
1.上样前请针对不同的细胞样本进行相应处理，减少细胞粘连，使细胞形成单细胞悬液；
1.1.贴壁细胞消化后可用含2%FBS的PBS或无酚红RPMI-1640培养基重悬，禁止使用高糖培养基，以减少自发荧光干扰；
1.2.组织消化后因有许多DNA从死细胞中泄露，导致细胞粘连，请在消化液中加入DNaseI 25ug/ml+5mM MgCl2,并在后续抗体染色中往staining buffer中添加DNaseI 25ug/ml+5mM MgCl2；
2.细胞活力会直接影响分选后的细胞活性，同时死细胞会有较强的自发荧光干扰分选，因此必需用PI或7AAD染料区分死细胞，染色五分钟，离心2次，洗去染料，才能做后期荧光分选；
3.为保证分选效率，建议上样细胞浓度不低于1×107/ml；
4.为保证细胞活性，请将样品置于冰上；
5.实验对照设计：
5.1.转染荧光蛋白的细胞样品，需提供为转染的细胞样品以供校正
5.2.多种荧光抗体标记的样品，需要提供(a) 为染色的细胞样品 (b)每一种荧光抗体单独染色的样品，以供仪器校正和荧光补偿。
6.预实验设计：
6.1.荧光蛋白标记的细胞系可直接上机分选，不需要预实验；
6.2.从组织中分离的细胞尤其是含量稀少的细胞，请先做小规模的预实验，以测定细胞含量以及优化分选策略；
7.所有样品在上机前必须转移至带滤网的FACS管内上样（FALCON，货号：352235）；
三．样品收集
1.活细胞收集：收集样品可选用不同规格离心管（5ml、15ml、50ml）和细胞培养板，请在分选前往离心管中加入1-2ml含有20%FBS的培养基，培养板中加入覆盖底面积的量；
2.DNA分离：收集管中提前加入PCR mix或lysis buffer；
3.RNA分离：收集管中提前加入Trizol或RLT buffer；
四．荧光素选择
实验采用多种荧光染色标记时，请用以下工具仔细对比，防止荧光发射光谱重叠，导致实验失败。
荧光光谱查看器：
http://www.bdbiosciences.com/cn/s/spectrumviewer
https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
五：MoFlo荧光通道信息：
激光器 | 带通滤片 | 常见染料 |
355 | 448/59 | DAPI, Hoechst |
620/29 | PI |
692/75 | BUV661 |
405 | 448/59 | DAPI, CFP, Alexa 405, eFluor 450 |
546/20 | eFluor 506 |
488 | 513/26 | EGFP, FITC, YFP, Alexa 488, Calcein AM |
576/21 | PE/R-PE |
620/29 | PI, PE-CF594, EB |
664/22 | PerCP, PE-Cy5, PE-Cy5.5, 7-AAD |
710/45 | PerCP-Cy5.5, PerCP-eFluor 710 |
795/70 | PE-Cy7 |
561 | 579/16 | Cy3, DsRed, tdTomato, PE, Rhodamine Red |
614/20 | mCherry, PI |
692/75 | PE-Cy5, PE-Cy5.5, 7-AAD |
640 | 671/30 | APC, Cy5, Alexa 647 |
722/44 | Alexa 700 |
795/70 | APC-Cy7 |
样品种类 | 细胞浓度 | 荧光标记 | 目的细胞群体 |
示例-1 HEK293T | 1×107/ml | GFP,PI | GFP |
示例-2 小鼠大脑消化细胞 | 2×107/ml | GFP-Alex488 PI CD31-Alexa647 CD146-PE-Cy7 | CD31-ALexa647+CD146-PE-Cy7 双阳性 |
六．样品信息表（上表）
分选实验室，请按照一下表格提供样品信息，以供分选是快速设定正确的荧光通道。
七．细胞分选所需时间参考
Frequency of cells of | 10% | 1.0% | 0.1% |
interest |
|
|
|
Starting number of | 1x107 | 1x108 | 1x109 |
cells required |
Time to sort 1x106 | 30 | 300 (5 hours) | 3000 (50 hours) |
cells (minutes) |
八．数据备份及分析
请自备空白光盘一张，用于拷贝实验数据，拷贝后请妥善保存实验数据。平台不承担任何因违反本
规定而导致的实验数据丢失、外泄等。严禁用U盘，擅自使用U盘者，将被禁用仪器3-6个月或取消仪器使用资格。
数据分析软件：Beckman Summit（可从Hu Lab拷贝）。
